Munkacsoportunk egyik kutatási témája a csirke matrilin-1 gén (Matn1) expressziós szabályozásának vizsgálata. A matrilinok családja egyike az extracelluláris mátrix kialakításában résztvevő fehérje családoknak és négy képviselője van (Matn1, Matn2, Matn3 és Matn4), melyek közül a legjobban jellemzett, a Matn1, a porcos vázelemekben fejeződik ki. A matrilin-1 gén egyedi sajátossága, hogy expressziója csak bizonyos fejlődési stádiumú porcsejtekre és a növekedési korong meghatározott (proliferatív és prehipertróf) zónáira korlátozódik. E sajátos kifejeződés miatt a matrilin-1 gént fejlődés- és szövetspecifikus marker génnek tekinthetjük. A gén szabályozó régiója igen komplex magába foglal egy 2011 bp-os promoter régiót és egy 1819 bp-os introni szakaszt is. Ezek a DNS régiók a kötőhelyei a csontnövekedés szabályozásában fontos szerepet játszó morfogéneknek és növekedési faktoroknak. A porc-specifikus génexpresszió szabályozásban kiemelkedő szerep jut a HMG-box DNS-kötő doménnel rendelkező Sox transzkripciós faktor család több tagjának (Sox9, Sox5, Sox6). A Sox9 felelős a mesenchyma sejtek kondenzációjáért és a porcdifferenciálódás elindításáért és a porcképződés fő transzkripciós faktorának tekinthető, jelenléte elengedhetetlen a SOX5 és SOX6 gének bekapcsolásához. A matrilin-1 génexpressziójához mindhárom Sox fehérje szükséges.
Korábbi transzgenikus egér kísérletekben a csoport kimutatta, hogy a specifikus transzgén kifejeződéshez elegendő akár a távoli promoter régiók, akár az introni régiók rövid promoterhez történő kapcsolása. Magas szintű expresszióhoz viszont mindhárom régió együttes jelenléte szükséges. A génexpressziót szabályozó DNS elemek pontosabb behatárolása során elvégzett számítógépes szekvenciaanalízis alapján több, az amniótáknál erősen konzervált, DNS szakaszt azonosítottak a TATA motívum közelében (Pe1, Ine) valamint a távoli promoter régióban (Dpe1, Dpe2).
Feladataim közé tartozott:
1.	a távoli szabályozó régiók feltérképezése és a rövid promoter elemeivel kialakított kölcsönhatásának tanulmányozása, a kérdéses DNS-elemek beépítése a rövid matrilin-1 promoter által meghajtott Luciferáz gén elé, ezáltal tranziens expressziós kísérletek végrehajtására alkalmas vektorok létrehozása a DNS-elem funkcionális és mutációs analíziséhez, valamint kotranszfekciós kísérletekhez,
2.	a funkcionális kísérletekben működő DNS elem DNS-fehérje kölcsönhatásainak vizsgálata in vitro: EMSA, supershift, sejtkivonatok és GST-fúziós, tisztított fehérjék segítségével,
3.	a jellemzett DNS-elemekhez kötődő új transzkripciós faktorok azonosítása szilárd hordozóhoz rögzített kétszálú oligonukleotidok és MALDI-tömegspektroszkópia, illetve kromatin immunprecipitáció segítségével.

1. A tranziens expressziós és kotranszfekciós kísérletekben két vektort használtam viszonyításként: a rövid matrilin-1 promoter (a -334 ÷ +67 promoter régió) által meghajtott luciferáz riporter-gént tartalmazó vektort (FO15Luc), illetve teljes hosszúságú, 5' végi matrilin-1 promoter (a -2011 ÷ +67 promoter régió) által meghajtott luciferáz riporter-gént tartalmazó vektort (AC8Luc). A konstrukciók szövetspecifikus aktivitását nagy denzitású mesenchyma sejtkultúrában (HDM), csirke chondrocita kultúrákban (CEC) és csirke fibroblasztokban (CEF) vizsgáltam. Az AC8Luc magas szövetspecifikus aktivitással bír: 18x nagyobb riporter aktivitást mutat chondrocitákban, HDM kultúrában csak 1,5x aktívabb, míg fibroblaszt kultúrában közel azonos aktivitású, mint az FO15Luc.
A távoli szabályozó régió feltérképezését olyan konstrukciók létrehozásával kezdtem, melyekben a 2011 bp-os promoter egyre rövidebb szakaszait az FO15Luc vektor rövid matrilin-1 promotere elé építettem. A PS-FO15Luc (-2011 ÷-948) chondrocitákban 9x , a PB-FO15Luc (-2011 ÷ 1134) 6x, a PE-FO15Luc (-2011 ÷ 1394) 7,5x nagyobb aktivitást mutatott, mind az FO15Luc, a PH-FO15Luc (-2011 ÷ 1741) aktivitása a kontrolléhoz hasonlóan alacsony volt. A HDM és a fibroblaszt kultúrákban a riporter aktivitások között alig volt eltérés. A magasabb chondrocita aktivitásért tehát a távoli promoter régió legalább 700bp-os (-2011 ÷ 1394) szakaszára szükség van. Ebben a fragmentumban vannak jelen az amnióta fajok között konzervált Dpe1 (-1863÷ -1807) és Dpe2 (-1717÷ -1644) DNS-elemek is, melyeken a DNS-kötő Sox5, Sox6 fehérjék felismerő szekvenciáinak nyomait lehet megtalálni. A két DNS-elem hatásának tanulmányozásához elkészítettem ezen elemeket külön-külön több példányban (1÷4) hordózó FO15Luc alapú transzfekciós vektorokat és tranziens expressziós kísérletekben vizsgáltam a Dpe1 és Dpe2 elemek porcspecifikus hatását a luciferáz aktivitásra. Azt tapasztalatam hogy, a Dpe1 3 kópiás jelenléte jelentősen (14x) megnövelte a porcspecifikus luciferáz aktivitást, 4 kópiában pedig (24x) növelte a rövid matrilin-1 promoter által hajtott riporter-gén aktivitást, ami még az AC8Luc aktivitását is meghaladta. A Dpe1-FO15Luc konstrukció (mely 1 kópiában tartalmazta a Dpe1 elemet) porcspecifikus aktivitása mindössze 1,5x volt nagyobb a kontrollénál, ami egybevágott a legrövidebb távoli promoter régiót, benne a Dpe1 elemet, tartalmazó PH-FO15Luc vektor aktiváló hatásával. A Dpe2 elem esetében ilyen hatást chondrocitákban nem tapasztaltam, itt inkább a HDM kultúrákban emelkedett meg kissé a riporter-gén aktivitás. Amikor a két elemet, illetve az azokat összekötő 90 bp-os DNS szakaszt (-1902 ÷ -1609) 1, 2, illetve 4 példányban az FO15Luc-ba építettem, a kapott transzfekciós klónok csirke chondrocyta kultúrákban mért relatív aktivitása még 4 kópia esetében is alig 3x volt nagyobb, mint FO15Luc aktivitása. Ha viszont a Dpe2 elemet 1, vagy 2 példányban a már 4 Dpe1 elemet tartalmazó rekombináns DNS-be építettem be a Dpe1 elemek és a rövid matrilin-1 promoter közé ( így kapva a 4Dpe1-Dpe2-FO15Luc, illetve a 4Dpe1-2Dpe2-FO15Luc konstrukciókat) a luciferáz aktivitás CEC kultúrában átlag 52%-kal csökkent a csak Dpe1 elemeket tartalmazó klónok aktivitásához képest (a 24x-ről 11x-re), bár még így is jelentősen meghaladta az FO15Luc aktivitását. A Dpe1 elemhez olyan transzkripciós faktorok kötődnek tehát, melyek nagymértékben növelik a rövid promoter aktivitását porcsejtekben, feltehetően elősegítve és stabilizálva a távoli promoter elemek kölcsönhatását a rövid promoter elemeivel, mint a Pe1 és Ine. A Dpe2 elem ezzel szemben - a kombináció módjától függő mértékben - csökkenti a Dpe1 elem aktiváló hatását.
A Dpe1 szerepét a porcspecifikus aktivitásban az is alátámasztja, hogy ha a Dpe1 elemet kivágtam (a -1850÷-1739 pozíciók közötti DNS szakasz, DDpe1/2-AC8Luc konstrukció) az 5�f végi szabályozó régió chondrocita specifikus aktivitása a felére csökkent (8,3x volt nagyobb az FO15Luc-énál), míg a CEF kultúrákban mért luciferáz aktivitás változatlan marad. Ha a deletált szakasz a -1926�€-1745 pozíciók közötti régiót érintette (DDpe1/1-AC8Luc), a porcspecifikus aktivitás az AC8Luc aktivitásának közel harmadára csökkent (csak 5,2x volt magasabb, mint az FO15Luc) és több mint felével lett alacsonyabb a HDM kultúrában mért luciferáz aktivitás is. Ezek az adatok azért is fontosak, mert a Dpe1 és Dpe2 elem közvetlen közelében egyéb, kevésbé konzervált, de irodalomból ismert cis-szabályozó aktivitással bíró DNS motívumok is azonosíthatók. Ilyen a Dpe1 elemtől 5’ irányban elhelyezkedő potenciális IKAROS kötőhely (mely a DDpe1/1-AC8Luc konstrukcióból a Dpe1 elemmel együtt hiányzik), illetve a Dpe1 elemtől 3’ irányban található DEF faktor felismerőhely (-1788 pozíció), vagy a Dpe2 elemben található másik DEF motívum (-1700 pozíció). Mivel ezek a felismerőhelyek igen közel fekszenek a konzervált DNS motívumokhoz, feltételezhetjük, hogy a hozzájuk kötődő fehérjék kölcsönhatásba lépnek egymással és ezáltal transzkripció szabályozó hatásuk lehet. Erre utal az is, hogy DIKAROS-AC8Luc konstrukció chondrocita specifikus aktivitása az AC8Luc-énnak valamivel több mint a felére csökkent és 7,6x volt magasabb az FO15Luc-énál. Ezzel szemben ahol az IKAROS és a Dpe1 elem is hiányzik (D Dpe1/1-AC8Luc) csak 5,2x magasabb riporter-gén aktivitást mértem. Végül a Dpe2 elem deléciója az 5’ végi régió porcspecifikus luciferáz aktivitását 42%-kal csökkentette, ami meglepő annak fényében, hogy magának a Dpe2 elemnek inkább gátló hatását figyelhettük meg.
A távoli promoter elemek és a TATA motívum közeli DNS elemek (Pe1, Ine, SI) közötti kölcsönhatás vizsgálatára a Pe1, Ine és SI elem in situ mutagenezisére volt szükség. A bevitt pontmutációk a csoportban előzőleg elvégzett  DNaseI és genomi footprinting, valamint metilációs interferencia analízis alapján lettek megtervezve és transzkripciós faktorok (Sox, NFI) kötőhelyének elrontását célozták meg. A Pe1 elemen korábban kétféle változtatást hajtottak végre: a Pe1M1 mutáció az elem egyik Sox- kötőhelyét tette tönkre, a Pe1M4 mutáció a kötőhelyek közötti összekötő szakaszt. Az Ine elembe egyenként háromféle mutációt vittek be, melyek közül az IneM2 az Ine elem Sox kötését teljesen tönkretette, míg az SI-en elvégzett mutációk egy NFI kötőhelyet változtattak meg. Mivel a távoli promoter elemekkel való kölcsönhatásra voltunk kíváncsiak a mutációkat az AC8Luc, illetve PS-FO15Luc konstrukciókban található rövid matrilin-1 promoterbe vittem be és a klónok szövetspecifikus aktivitását tranziens expressziókban vizsgáltam. Előállítottam az FO15Luc Pe1M1-IneM2 és a Pe1M1-SI2dm, valamint Pe1M4-SI2dm mutáns formáit és a nekik megfelelő AC8Luc változatokat is, ezeket szintén tranziens expressziókban teszteltem.
 A Pe1M1 mutáció mindkét hosszú promoteres konstrukcióban tizedére (majdnem az FO15Luc szintjére), míg a P1M4 mutáció hozzávetőleg kétharmadára csökkentette a porcspecifikus aktivitást és alig változtatta meg a HDM kultúrában és a fibroblasztokon mért riporter-gén aktivitásokat. Az SI elem mutációja minden általunk vizsgált sejtkultúrában jelentősen (ötödére a HDM és fibroblaszt, tizedére a chondrocita kultúrák esetében) csökkentette a riporter gén aktivitást, jelezve, hogy a korábban gátló hatásúnak hitt NFI transzkripciós faktor kötődése nélkülözhetetlen, pozitív szabályozó szerepet játszik a gén regulációjában. A két elem együttes mutációja az AC8Luc aktivitását minden sejtkultúrában az FO15Luc aktivitási szintje alá (Pe1M1-SI2dm), illetve annak közelébe (Pe1M4-SI2dm) vitte. Mindez arra utal, hogy a két faktor együttes jelenléte szükséges a jelentős szintű porcspecifikus génműködéshez és távoli DNS-elemek aktiváló hatásának közvetítéséhez, bár adataink arra utalnak, hogy az SI-elemnek inkább általános aktiváló hatása van. A D Pe1M1- D IneM2-AC8Luc mut疣s porcspecifikus aktivit疽a szint駭 FO15Luc porcspecifikus aktivit疽疱al mozog egy szinten. 
 Korábban a csoport igazolta a LIE1 elem kölcsönhatását Sox9 és NFI fehérjékkel, de szerepe ellentmondásos volt, mert transzfekciós kísérletekben több kópiában sem növelte a homológ minimál promoter porcspecifikus aktivitását. Ezeknek az elemeknek a hatását ezért olyan vektorokon vizsgáltuk, melyekben az introni elemeket a nagy aktivitású Col2a1 gén 48bp-os enhancer elemével kombináltuk. Az alap a  8xECol2a1-FO15Luc plazmid volt, amit a több kópiás Col2a1 enhancer elem matrilin-1 rövid promoter elé építésével kaptunk és 97x nagyobb porcspecifikus aktivitást mutatott, mint FO15Luc. A transzfekciós adatok alapján a 8xECol2a1-8xLIE1-FO15Luc konstrukció viselkedése mindhárom típusú sejtkultúrában lényegében azonos volt a kiindulási, 8xECol2a1-FO15Luc konstrukcióéval, vagyis ebben a környezetben a LIE1 elem hatása nem érvényesült. A 8xECol2a1-8x102-FO15Luc konstrukció azonban HDM kultúrában 75%, CEC kultúrában 77% és CEF kultúrában 84%  aktivitáscsökkenést okozott, ami a transzkripciós szabályozásban betöltött negatív szerepére utal. A 102 bp-os és a LIE1 elemet 8 kópiában az irodalom szerint inaktív Col2a1 rövid promoter által meghajtott luciferáz gén (8xECol2a1-PCLuc) elé is beépítettük. A 8xECol2a1-PCLuc porcspecifikus aktivitása PCLuc-hoz képest 23x-ra nőtt. A 102 bp-os elemek jelenléte mindhárom kultúrában 50% körüli aktivitáscsökkenést okozott a 8xECol2a1-PCLuc-hoz képest. A LIE1 elemek jelenléte pedig CEC kultúrában 50%-os, HDM kultúrában 39%-os és CEF kultúrában 22%-os aktivitás csökkenéssel járt. Adataink alapján úgy tűnik, hogy a 102 bp-os elem általános transzkripciót gátló hatással bír, míg a LIE elem gátló hatása késői proliferatív porsejtekben a legmarkánsabb.

 2. Elkezdtem az EMSA („electrophoretic mobility shift assay”) kísérleteket a rekombináns Sox9 fehérjével és kimutattam, hogy a Dpe1 elem három különböző mobilitású nukleoprotein komplex létrehozására képes, míg a Dpe2 elemen két különböző mobilitású komplex alakul ki. Rekombináns Sox5 és Sox6 fehérjékkel nem sikerült kötést kimutatni. Terveztem EMSA és supershift kísérletek elvégzését CEC sejtmagi kivonatokkal is.
Megerősítettem egy korábbi EMSA eredményt, mely a HMGB1 fejérje Ine elemhez való kötődésére utal. Itt HMGB1 ellenanyaggal supershiftet sikerült kimutatni, bár a kísérlet körülményeit finomítani kell még. 
Párhuzamosan elkezdtem a kotranszfekciós elő kísérleteket egy HMGB1 expressziós klónnal és az FO15Luc, AC8Luc,  D Pe1M1- AC8Luc, D IneM2-AC8Luc riporter-g駭 konstrukcikal. Az eredm駭yek alapj疣 a HMGB1 expresszia legink畸b a HDM kult侔疚ban neli a lucifer痙 aktivit疽t. Legnagyobb hat疽t (2x) az AC8Luc eset饕en lehetett megfigyelni, a Pe1M1 mut當i� cskentette ezt a hat疽t, az IneM2 eset饕en a k﨎駻letek nem voltak egy駻telműek, mert voltak olyan HMGB1 koncentr當i ahol a lucifer痙 aktivit疽 ak疵 a 4x-e lett a HMGB1 n駘k�li aktivit疽nak.

3.Elkezdtük a mágneses gyöngyökhöz rögzített Pe1, Ine és LIE elemekhez chondrosarcoma és CEC sejtmagi kivonatból kötődő transzkripciós faktorok azonosítását MALDI tömegspektroszkópia segítségével. Itt a HMGB1 fehérje kötődését sikerült kimutatni az Ine elemhez, ami megerősíti  EMSA adatainkat. Ennek alapján chondrosarcoma és CEC és CEF sejtmagi kivonatokból ChiP (kromatin immunprecipitáció) kísérletet terveztünk Dr.Bálint L.Bálint közreműködésével a Dpe1, Pe1 és Ine elemeken. Az első kísérletekben a HMG fehérje kötődését az Ine, a Pe1 és a Dpe1 elemhez CEF sejtmagi kivonatból sikerült egyértelműen kimutatni, illetve a Dpe1 elemnél chondrosarcoma magi kivonatokban is volt HMG kötődés.
MALDI tömegspektroszkópia segítségével sikerült kimutatni az NFI (nuclear factor I) fehérje család tagjainak (NFI-A, illetve NFI-C) kötődését a LIE1 elemhez. Ez  megerősíti a kutatócsoport korábbi EMSA, supershift és „pull down” kísérleti adatait, pontosítja ezeket és lehetőséget biztosít további in vitro kísérletek tervezésére.